Efter at mederne blev væltet af perserne som den dominerende kraft i det gamle Iran, blev Assyrien styret af det persiske Achaemenid Empire (som Athura) fra 549 f.Kr. til 330 f.Kr. (se Achaemenid Assyria). Mellem 546 og 545 f.Kr. rebellede Assyrien mod den nye persiske dynasti, som havde usurped det tidligere median-dynasti. Opstanden centreret omkring Tyareh blev til sidst kvæstet af Cyrus den Store.Assyrien synes at have vundet sig dramatisk og blomstrede i denne periode. Det blev et vigtigt landbrugs- og administrationscenter i Achaemenid Empire, og dets soldater var hovedstjerne for den persiske hær. Faktisk blev Assyrien selv stærk nok til at rejse en anden fuldskala oprør mod det persiske imperium i 520-519 f.Kr.Perserne havde brugt århundreder under assyrisk dominans (deres første regent Achaemenes og hans efterfølgere, der har været vassaler af Assyrien), og assyrisk indflydelse kan ses i Achaemenidskunst, infrastruktur og administration. Tidlige persiske herskere så sig som efterfølgere til ashurbanipal, og Mesopotamian Aramaic blev bevaret som Empiriens lingua franca i over to hundrede år, og græske forfattere som thucydider henviste det stadig til det assyriske sprog. Nineveh blev aldrig genopbygget, og 200 år efter, at den blev afskediget, rapporterede Xenophon kun et lille antal assyrere, der bor blandt sine ruiner. Omvendt blev den gamle by Assur igen en rig og velstående enhed.Det var i 5. århundrede f.Kr. Assyria, at det syriske sprog og Syriac script udviklede sig. Fem århundreder senere kom disse senere til at have en global indflydelse som det liturgiske sprog og det skrevne skript for den syriske kristendom og den tilhørende syriaklitteratur, som også opstod i Assyrien, før de spredte sig gennem hele Det Nære Østen, Lilleasien, Kaukasus, Centralasien, Det Indiske Subkontinent og Kina. [Persiske folk][Thukydid]